毛细管电泳法CE/HPCE:以高压直流电为驱动力,毛细管为分离通道根据样品各组分的电泳和分配行为差异而实现分离的一类分析技术。由于毛细管散热效率高,可以应用更高电压
特点:操作简单、分离效率高、样品用量少、运行成本低
缺点:迁移时间重现性、进样准确性、检测灵敏度低于HPLC,不适于制备性分离
第一节:毛细管电泳基础理论电渗和电渗率电渗:液体相对于带电管壁移动的现象
Zeta电势:在电场作用下,固液两相的相对运动发生在紧密层和扩散层之间的滑动面上,此处的电动电势即为Zeta电势百科解释:Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差
电渗流EOF:由于离子是溶剂化的,当扩散层的离子在电场中发生迁移时,将携带溶剂一起移动,形成(我为你翻山越岭却无心看风景是什么意思?急于找到你,来到你的身边,以至于在路途上没看风景的心情!所爱隔山海,山海皆可平。我跟你隔着山山水水,它们都很美,路上遇到的人也很可爱,但是一想到路的那头有你,我就无心停下来赏花观水,那些想跟我交流的人我也不去搭理。)电渗流
,是电渗淌度,是介电常数,是黏度
在普通毛细管电泳条件下,电渗流从正极流向负极。Zeta电势越大、双电层越薄、电荷密度越大、粘度越小,电渗流越大。一般电渗流速度是电泳速度5~7倍
电泳是在电场作用下,带电粒子在缓冲溶液中定向移动的现象
,V为毛细管两端电压,L为毛细管总长度
对于一个离子淌度可近似为:,为离子的Zeta电位,表面电荷越大,质量越小,Zeta电势越大
在实际溶液中离子活度系数、溶质分子的离解程度均对离子的淌度有影响,用表示
表观淌度粒子在毛细管内运动速度是两种速度矢量和称为表观淌度用表示
分离效率和谱带展宽理论塔板数和塔板高度,,tm为流出曲线最高点所对应的时间称为迁移时间,Ld为有效长度(进样端到检测端的距离)
毛细管电泳法分离柱效方程:
增大电压,增大Ld/L可以提高柱效,大分子物质扩散系数小,所以分离效果好,毛细管电泳法特别适用于生物大分子
引起谱带展宽的因素电渗流驱动下扁平流
影响因素:
按填充物质性状:自由溶液、非自由溶液
按分离机制:电泳、色谱、电泳/色谱
除凝胶电泳法和电色谱法需用填充型分离柱外其余几种仅是基于使用的运行缓冲溶液(BGE)不同
毛细管凝胶电泳法(CGE)、毛细管等电聚焦法(CIEF)、毛细管等速电泳法(CETP)主要用于生物大分子
药物分析常用毛细管区带电泳CZE和胶束电动毛细管色谱法MECC
毛细管区带电泳法胶束电动色谱法MEKC:是以胶束为假固定相的一种电动色谱法。又称胶束电动毛细管色谱法(MECC)
可以分离CZE中无法分离的中性化合物
毛细管电色谱法CEC:是在毛细管内填充、内壁涂覆、键合或交联色谱固定相,以电渗流驱动流动相完成分离的微柱色谱技术
分离机制:被测组分根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度差异得以分离
分离条件选择:首先固定相,其次流动相和缓冲液。根据固定相和流动相性质,CEC可分为反相、正相、离子交换和分子交换。使用的色谱柱有填充柱、开管柱、整体柱
缓冲液可以是水溶液或有机溶液。pH对溶质的保留影响很大,在pKa附件调节pH易于获得较高选择性。为煎炒焦耳热,流动相通常采用低浓度缓冲溶液。
常规条件无法改善分离时,可以考虑加压毛细管色谱(P-CEC)或混合固定相填充CEC柱
气泡陈胜时导致分离失败的主要原因,一般出现在样品塞子与填料交界处。采用P-CEC可以避免气泡产生,缩短分离时间
包括高压电源、电解液槽和进样系统、毛细管及其温控系统、检测器、记录数据处理系统
高压电源防止高压放电:干燥、隔离、降低分离电压
毛细管柱常用弹性熔融石英毛细管。
对于从未使用过的未涂渍柱,使用前用5~15倍柱体积NaOH,水,及3~5倍柱体积运行缓冲溶液冲洗(平衡毛细管),或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤。更换缓冲溶液也需要用运行缓冲溶液平衡。
对于蛋白质等需要对毛细管比进行改性处理(物理涂覆、化学键和、交联)
进样系统采用无死体积进样方式,进样系统包括动力控制、压力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制
常用压力进样
检测器柱上检测(毛细管出口端除去不透明保护层):紫外、荧光
柱后检测:电化学、质谱
激光诱导荧光(LIF):常用氩离子激光器
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