Plant Biotechnology Journal
doi: 10.1111/pbi.13026
Vanika Garg1,2, Aamir W. Khan1, Himabindu Kudapa1, Sandip M. Kale1, Annapurna Chitikineni1, Sun Qiwei3,Mamta Sharma4, Chuanying Li3, Baohong Zhang5, Liu Xin3 , P.B. Kavi Kishor2 and Rajeev K. Varshney1,*
SummaryAscochyta blight AB枯萎病是限制全国范围的鹰嘴豆的产量的主要生物胁迫因素。为了剖析鹰嘴豆抵抗AB的复杂机制，使用转录组，small RNA 和降解组测序方法。
- 在两个时间点（接种第3天和第7天）,在控制和胁迫的条件下，对20种样品的转录组进行了测序，包括两种抗性基因型、两种易感基因型和一种渗入型，共鉴定出6767个表达差异基因DEG。这些DEG主要与发病相关的蛋白、抗病基因，如NBS-LRR，细胞壁生物合成和各种次生代谢合成基因有关。样品的small RNA测序结果鉴定出651 miRNAs，其中包括478个已知的miRNAs，173个新miRNAs。在不同基因型、状态和时间点，共有297个miRNA差异表达。使用降解组测序和计算机方法，预测了629个miRNAs的2,131靶标。smallRNA和转录组数据结核确定了在抗性和易感基因型中表现相反的表达，并且在AB感染期间可能转录后沉默的基因子集的 12个miRNA-mRNA相互作用对。这项研究的综合性分析the comprehensive integrated 为鹰嘴豆胁迫相关的转录动力学和调控网络分析提供了更好的简介，且为鹰嘴豆的改良提供了候选基因。
在这项研究中，20个样品代表两个温和的抵抗基因型(ICCV 05530 and ILC 3279)，两个易感基因型 (C 214 and Pb 7)和一个渗入品系（BC3F6)，在两个接种时间点进行测序。20个样品的paired-end sequencing 共产生了1.351亿个reads。严格的质量过滤后供进一步分析，再比对到鹰嘴豆的基因组，并对基因按照基因型和时间条件进行命名。
Differential gene expression analysis- 差异基因表达汇总
为了研究差异基因的表达情况，过滤掉低质量的表达基因（FPKM>=1，且定量状态为ok），发现一个样品中至少表达了21,527个基因。过滤掉低表达基因，使用Cuffdiff 计算34成对组合中的基因倍数的变化。总共发现6,767个基因在每两个样品间显示出明显的差异表达。
在BC3 F6-C-3d :Pb 7-C-3d=Star 284 (183 up-regulated; 101 down-regulated):Over 2607 (953 up-regulated; 1654 down-regulated)
在AB感染后，第3天的下调趋势更加明显，第7天则发现每种基因型中更多的基因被上调
在对照条件下，从不同基因型中鉴定出大量的DEG，在第3 dpi时ILC 3279与Pb 7之间的DEG数量最多（901上调； 255下调255），而ILC 3279与C 214之间的DEG最高（812上调； 1290下调）在第7 dpi（图1b）。
同样，在感染后，在第3 dpi时发现ILC 3279和Pb 7（上调811；下调581）之间的最大DEG，在第7处ICCV 05530和C 214（上调953；下调1654）之间发现最大DEG。 dpi（图1c）。
可以看出，每种组合的DEG大部分都是唯一的。
这些结果表明，鹰嘴豆中真菌感染后基因型和阶段特异性反应。
- GO富集分析
在6,767个重要的DEGs中，使用blastx注释了5,309个基因，并GO将其分配给4,559个基因，共获得10,962个GO项。
可以看出，DEG的GO分配给 the biological process (3632), molecular function (3744) 、 cellular component (3586) .
对DEG的GO富集分析表明，
在生物过程类别项目下，显著的terms是：oxidation-reduction process (GO:0055114), regulation of transcription (GO:0006355), defense response to fungus (GO:0050832), response to chitin (GO:0010200), response to salicylic acid(GO:0009751), response to jasmonic acid (GO:0009753), response to abscisic acid (GO:0009737),ethylene-activated signaling pathway (GO:0009873) 、response to auxin (GO:0009733)
在分子功能类别中，显著的terms是：ATP binding (GO:0005524), protein serine/threonine kinase activity (GO: 0004674), oxidoreductase activity (GO:0016491), peroxidase activity (GO:0004601), hydrolase (GO:0016787) and monooxy genase activity (GO:0004497)
在细胞成分类别中，最为丰富的是： plant-type cell wall (GO:0009505), apoplast (GO:0048046) and anchored component of membrane (GO:0031225)
显著丰富的GO项目进一步聚类以获得高度连的clusters。
这个F 2a，也是GO的富集性差异基因的图，可考虑换个方式作图。KEGG差异基因通路此外，为了理解分子机制，使用KEGG进行了DEGs分子途径分析。发现DEGs共代表134条途径。
富集分析表明，在AB感染下，最富集的途径是：metabolic pathways (ko01100), biosynthesis of secondary metabolites (ko01110), plant hormone signal transduction (ko04075) and plant-pathogen interaction (ko04626)
4.在该项研究中，891个transcription factor（TF） encoding genes 属于50个基因家族。
其中，代表最多的TF家族是 bHLH (91), ERF (90), MYB (75), NAC (68) and WRKY (65) ；并且达县大量的其他TF家族（如C2H2，bZIP和MADS）在应激条件下显示出不同的表达模式；
研究了在应激条件下所有基因型中10个最富集的差异表达特异性。可以看出，在第7天时，所有基因型中差异表达的TF编码基因的数量都更高。且抗性基因型比易感基因型差异表达的WRKY成员的数量相对更多。
例举相关的文章和其中类似的结果进行陈述。
防御反应设计植物中大量的转录重编程，使用聚类分析，确定了不同时间点和易感基因型具有相似表达趋势的基因，其中相似表达谱，DEGs分为六个主要clustered。
在控制条件下，抗性基因型上调趋势更为深刻。clusterI 由第3dpi或者第7dpi显示抗性基因型诱导表达的基因组成。这些基因的GO富集表明，大多数基因参与了salicylic acid, metabolic process, oxidation-reduction process, flavonoidbiosynthetic process and response to biotic stimulus。并且，抗病基因簇重要组成成员为chitinases (Ca_04405), CC-NBS-LRR (Ca_08361) and dirigent protein (Ca_2072
