鹿血系鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿C. elaphus Linnaeus的血液，具有养血益精、行血祛瘀、消肿等功效。因资源稀缺，致使一些伪品出现，表现为用其他种类的动物血替代鹿血，或者在鹿血中掺入其他动物血液等[1]，也有以马鹿血冒充梅花鹿血的现象。性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等传统中药鉴定方法在血液类中药的鉴定中有一定的局限性，因此，鹿血的鉴定和质量评价需要新的技术方法。分子鉴定快速、准确，是传统鉴定方法的有效补充，蛇类（乌梢蛇和蕲蛇）药材分子鉴别法成为《中国药典》2015年版收录的第1个中药分子鉴定方法[2-3]。近些年，分子鉴别技术已经在很多动植物鉴定中得到了成功应用，如陈士林等[4-5]用分子鉴别技术对植物的研究；鹿源类中药材的鉴定研究也有相关报道[6-8]。
2003年加拿大学者Hebert等提出DNA条形码（DNA barcoding），并选择线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）作为动物种属鉴定的首选片段[9-10]。虽然COI作为动物条形码鉴定标签片段的研究已有很多报道[11-17]，但是COI序列并非适用于所有动物的鉴定，在94.1%的腔肠动物中，COI序列之间的差异均小于2%，说明COI不适合鉴定该类群[18]。本研究初期对鹿血及非鹿类动物血提取的COI基因进行序列扩增，部分样品得到的结果不稳定，经实验最终选择了线粒体细胞色素b（cytochrome b，cytb）作为研究的目的基因[19-21]。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法[22-28]分析鹿血及非鹿类（猪、牛、羊、鸭）血液cytb基因的特异性，为鹿血的真伪及掺伪鉴定提供依据。
1材料与仪器1.1 材料
梅花鹿血和马鹿血购自河北省承德市承德县鹿养殖场，非鹿类动物血（猪血、牛血、羊血、鸭血）购自市场，经COI、cytb基因片段测序确认；Blood Cell Culture DNA Mini Kit（25）试剂盒（QIAGEN，货号13323）；限制性内切酶EcoRV、MseI及DNA Marker（NewEngland Biolabs公司）；DNA聚合酶（Genstar公司，2×Hotstart Taq PCR StarMix，A033-101）；引物cytb、COI（华大基因）；Mighty TA-cloning Kit、A-overhang mixture（Takara公司）。
1.2 仪器
Sub-cell GT型BIO-RAD电泳仪、Gel DocTM XR型BIO-RAD照胶仪、S100TM Thermal Cycler型BIO-RAD PCR仪（TOYOBO公司，日本）；Eppendorf型Centrifuge 5424离心机（张家港市九洲特种离心机制造有限公司）。
2方法2.1 血液基因组DNA提取
严格按照试剂盒（QIAGEN，货号13323）说明书进行。
2.2 cytb基因片段的PCR扩增及测序
R：3’-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-5’），PCR扩增。扩增体系：Genstar聚合酶（1 U/μL）5 μL，上下游引物各0.2 μL，模板DNA 0.3 μL，加灭菌去离子水至总体积为10 μL，共7个10 μL PCR体系。扩增条件：94 ℃预变性3 min后，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，34个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
取上述PCR产物2 μL用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，剩余68 μL用试剂盒（Tian(见到日出我便不能自己下一句是什么？而你就是日出，于是，所以，我爱你)Gen，货号04217）进行纯化，连接到pMD20-T载体（Takara，货号AK4602），并转化到DH5α感受态细胞中，LB Amp+平板培养基（Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g、NaCl 10 g去离子水配制1 L），37 ℃恒温箱中培养16 h，挑取阳性克隆，放入400 μLLB Amp+液体培养基中37 ℃振荡培养2 h。重组子经菌液PCR检测后，由华大基因测序。
2.3 限制性内切酶的选择
软件分析“2.2”项下得到的序列，找到鹿血区分非鹿类血及梅花鹿血区分马鹿血特有的酶切位点，示意图见图1。
2.4 PCR产物的RFLP分析
2.4.1 PCR-RFLP法区分梅花鹿血、马鹿血及非鹿类动物血基因组DNA 限制性内切酶EcoRV切割鹿血和非鹿类动物血基因组DNA的PCR产物，10 μL体系中含PCR产物2 μL，0.3 μL EcoRV酶，1 μL 10×Buffer，6.7 μL灭菌去离子水，混匀，放入37 ℃恒温箱中1 h，切割产物用3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。同法MseI切割梅花鹿血和马鹿血基因组DNA的PCR产物。
测定提取的基因组DNA浓度，并稀释至相似浓度且A260在0.1～1.0。
（1）在鹿血基因组DNA中加入10%～90%非鹿类动物血基因组DNA，混匀，经PCR扩增，按照“2.4.1”项下步骤用EcoRV切割及电泳检测。
（2）根据项“2.4.2（1）”项下的结果，在鹿血基因组DNA中加入1%～9%非鹿类动物血基因组DNA，混匀，进行PCR。按照“2.4.1”项下步骤用EcoRV切割及电泳检测。
（3）同法分析梅花鹿血基因组DNA中掺入马鹿血基因组DNA的检测限。且所有的实验独立重复3次以上。
3结果与分析3.1 限制性内切酶选择结果
PCR扩增后，得到各样品cytb基因通用序列长度：梅花鹿血472 bp、马鹿血472 bp、猪血463 bp、牛血473 bp、羊血473 bp、鸭血473 bp。经软件分析，找到鹿血区别于非鹿血的酶切位点EcoRV：前者基因序列被切成大小为287、185 bp的2个片段，后者基因未被切开；梅花鹿区别于马鹿的位点为MseI：前者基因序列被切成大小为281、191 bp的2个片段，后者被切成大小为281、126、65 bp的3个片段。结果见图1。
3.2 限制性内切酶EcoRV切割鹿血和非鹿血基因组PCR产物结果
经EcoRV切割后，鹿血基因组被切为2个片段（287、185 bp），非鹿血基因组未被切开，与“3.1”项下软件分析结果一致。结果见图2。
3.3 鹿血基因组DNA中加入不同比例非鹿类基因组DNA酶切结果
由图3可知在鹿血基因组DNA中加入的非鹿血（猪、牛、羊、鸭的结果相似，未一一列出）基因组DNA少于3%时，EcoRV切割后只有大小为287 bp和185 bp的2条带（鹿血），在500 bp左右处未见明显条带，即未能检测到样品中的非鹿血DNA。
3.4 限制性内切酶MseI切割梅花鹿血和马鹿血基因组PCR产物结果
经MseI切割后，梅花鹿血和马鹿血基因组DNA分别得到2条带（281、191 bp）和3条带（281、126、65 bp），与“2.1”项下软件分析结果一致（图4）。
3.5 梅花鹿血基因组DNA中加入不同比例马鹿血基因组DNA切割结果
由图5可知，在梅花鹿血基因组DNA中加入的马鹿血基因组DNA少于6%时，MseI切割后，只有281 bp和191 bp处的2条带（梅花鹿），即未能检测到样品中的马鹿DNA。
上述结果可得出，方法PCR-RFLP可区分不同基源的鹿血及非鹿类血液，但在梅花鹿基因组DNA中加入的非鹿类动物基因组DNA比例小于3%，或者加入的马鹿血基因组DNA的比例小于6%时，此方法将无法鉴别。
4讨论市售掺伪鹿血是加入一定比例的其他动物血液，但由于本实验中购买的几种血液含水量、杂质等有差异，等量的血液用同一个试剂盒在相同的试验条件下提取基因组DNA，其含量差别较大，所以在鹿血中直接加入不同比例的非鹿类或者不同基原鹿血互掺，然后提取基因组DNA，将无法准确定量各血液基因组DNA的含量。本试验采用先单独提取不同血液的基因组DNA并稀释至浓度相近，然后在基因组DNA加入不同比例其他血液基因组DNA的方法进行试验，所以本研究中得到的检测限度是否适用于血液直接掺伪，还需进一步验证。
鹿血为梅花鹿和马鹿的血液，从经济学角度考虑，市场上只存在以马鹿血代替梅花鹿血的情况，故只做了梅花鹿血基因组DNA中加入马鹿血基因组DNA的检测限度，未做马鹿血基因组DNA中加入梅花鹿血基因组DNA检测限度的研究。
PCR-RFLP方法虽已在生物鉴定中广泛应用，但其也存在一定的局限性，比如一些序列更改：单点突变、替换，以及目标序列中的缺失都可能导致限制位点的缺失，从而得到不正确的结果；另外，也有学者认为设计和建立一种PCR-RFLP方法需要进行基因以及限制酶的种类和数量的选择，此过程比较繁琐[26,30]。
梅花鹿血中掺入马鹿血液及常见的猪、牛、羊、鸭的血液可被检测出，对于其他掺伪来源的血液能否被检出，需要收集更多样品来验证；cytb是线粒体基因，为母系遗传基因，若采集血液的动物是杂交品种，本方法只能检测到母系基因组DNA，则检测结果存
