口服胶囊递送siRNA为治疗需定期注射药物的疾病提供新的策略。
但是由于消化系统的障碍导致siRNA口服吸收效率低下，生物利用度低。目前仍缺乏能够克服障碍的技术，阻碍了口服siRNA临床应用。近日，来自苏州大学的殷黎晨教授团队进行了氟化小尺寸纳米胶囊口服递送siRNA抗炎治疗的相关研究。研究成果以“Oral Delivery of siRNA Using Fluorinated, Small-Sized Nanocapsules toward Anti-Inflammation Treatment”为题于2022年12月27日发表在《Adv. Mater.》上。
本文开发了小尺寸氟化纳米胶囊（F-NCs），介导TNF-α siRNA口服用于抗炎治疗。
纳米胶囊具有二硫交叉连接外壳结构，在胃肠道中具有较强稳定性。小尺寸（约30纳米）和碳氟化物辅助排斥粘液蛋白吸附，F3-NCs显示出良好的粘液渗透和肠道运输能力，而不损害肠道紧密连接，相对于静脉注射，其口服生物利用度达到20.4%。二硫交联剂可在目标细胞内裂解，导致NCs解体和siRNA释放，提高TNF-α沉默效率。在小鼠急性和慢性炎症模型中，口服F3-NCs能有效抑制TNF-α，表现明显的抗炎效果。本研究为口服siRNA传递提供了一项变革性策略。
图1 体外巨噬细胞中NCs和细胞内TNF-α siRNA传递效率表征
F-NCs通过原位自由基界面聚合法制备，由于siRNA具有负表面电荷，带正电荷的单体（N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺，APm）可通过静电作用自发聚集在siRNA周围。含有全氟化物的单体，中性单体，都可以通过静电作用自发聚集在siRNA周围。
然后，用过硫酸铵（APS）启动原位自由基聚合，在siRNA周围产生一个交联的、可清除GSH的聚合物外壳，形成siRNA包封的Fx-NCs。
琼脂糖凝胶电泳显示，聚合过程中，siRNA的完整性并未受到破坏，通过动态光散射（DLS）测量。当PFA含量增加时，F-NCs Zeta电位下降，因为氟碳的引入减少NCs中阳离子氨基的相对数量。透射电子显微镜（TEM）观察进一步显示，N-NCs和F3-NCs的直径约为25纳米，大小分布均匀。siRNA稳定封装在NCs内。PH实验证明NCs的大小不受pH值变化的影响，无siRNA预先释放，NCs可保护siRNA在血清、肠液和胃液中不被核酸酶水解。
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以上结果表明，交联聚合物NCs对siRNA进行紧密包裹，提高GI的稳定性，避免货物过早释放，同时siRNA在细胞膜中有效释放，从而提高基因沉默效率。
图2 氟化NCs介导有效的粘液渗透和肠道吸收
为探究F-NCs粘液渗透能力，采用多粒子追踪（MPT）实验评估F-NCs在新鲜小鼠肠道粘液中的布朗运动。
与N-NCs相比，F-NCs表现出更强扩散能力，与氟化水平呈正相关。光漂白/恢复实验显示光漂白过程中黄圈内荧光强度下降与含FAM-siRNA的NCs扩散效率呈负相关。证实在NCs中加入碳氟化合物可以增强其穿透粘液的能力，主要归因于其独特疏水和疏脂特性，防止粘液糖蛋白吸附在NCs表面。最佳全氟碳化物含量对平衡粘液蛋白和肠细胞亲和力至关重要。内吞和外吞作用事上是细胞转运过程中两个重要过程。研究人员研究F3-NCs在Caco-2细胞单层转运机制，F3-NCs摄取水平在4℃或mβCD下明显下降，表明洞室介导的内吞作用途径。monensin和brefeldin A使F3-NCs细胞内含量分别增加到210%和190%，证实两种途径都参与F3-NCs外吞作用。
图3 口服NCs介导对LPS诱导ALF高效抗炎的TNF-α沉默
口服含TNF-α siRNA的F3-NCs在体内TNF-α沉默和抗炎作用使用TNF-α沉默小鼠进行探讨。脂多糖（LPS）/D-半乳糖胺（D-GalN）用来诱发ALF。
TNF-α分泌没有被包被scramble (scr) siRNA的F3-NCs改变，表明TNF-α siRNA序列特异性沉默。对比静脉注射或口服F3-NCs在不同siRNA剂量下下调血清中TNF-α水平和肝脏中TNF-α mRNA水平的效率发现，在TNF-α/TNF-α mRNA抑制水平为70%时，口服F3-NCs相对于静脉注射F3-NCs的生物利用度分别为16.9%和18.7%。F3-NCs还使血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平分别下降70%和65%，表明对肝脏损伤具有保护作用。H&E染色肝脏切片也证实F3-NCs在缓解炎症症状方面具有显著疗效。
图4 口服NCs介导的TNF-α沉默和抗炎作用对caerulein诱导的AP有明显作用
接着研究人员分析口服含TNF-α siRNA的F3-NCs对caerulein诱导AP的抗炎功效。结果显示F3-NCs对血清中TNF-α水平和胰腺中TNF-α mRNA水平抑制率分别为65%和60%，超过了N-NCs。因此，F3-NCs降低血清中淀粉酶水平、胰腺髓过氧化物酶（MPO）活性和胰腺干/湿重量比，表明对胰腺坏死、中性粒细胞浸润和水肿具有抑制作用。H&E染色胰腺组织的组织学分析显示，用F3-NCs处理后，水肿、炎症细胞浸润和胰腺坏死减少。总之，以上结果共同证实F3-NCs在减轻caerulein诱导的胰腺炎症和损伤方面具有理想疗效。
图5 口服NCs介导的高效抗炎性TNF-α沉默治疗胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）
F3-NCs每三天口服200μg TNF-α siRNA/kg，可明显在24天至60天观察期内降低胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）小鼠血清中TNF-α水平。口服F3-NCs后，关节炎评分下降，肿胀爪子、脚踝和膝盖明显缩小。相比之下，甲氨蝶呤（MTX）在TNF-α下调方面起效较慢，这是MTX在临床上一个主要缺陷。CT扫描也显示F3-NCs极大缓解了CIA小鼠表面骨侵蚀以及骨密度下降水平。最后，滑膜组织H&E染色显示，F3-NCs给药后明显抑制滑膜增厚和粒细胞浸润，减少了45%软骨退化，同时增加软骨厚度和软骨细胞的数量。
总之，本文构建了一个高效口服siRNA传递系统，该系统基于氟化小尺寸、可逆交联的NCs，能够抵抗胃肠道内恶劣环境并同时克服肠道吸收和全身转染屏障。可逆交联聚合物外壳使NCs具有较高siRNA包被效率和较强稳定性。由于其小尺寸和内置全氟碳段，NCs具有强大的粘液穿透和跨上皮的吸收能力，而不损害肠道紧密连接，性能最好的是F3-NCs。相对于静脉注射，F3-NCs具有高口服生物利用度，高效巨噬细胞中以氟化强化方式内化，二硫化物交联裂解促进siRNA释放并增强基因沉默。在急性炎症和慢性炎症小鼠模型中具有优异的抗炎效果。本研究为口服siRNA递送提供了一个变革性平台，用于口服核酸有效载荷以对抗各种人类疾病。可填补口服siRNA传递系统的临床空缺。
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