引物设计，so easy - 飞外

（图多杀流量，慎入）

又是一年入学季，又有许多小白往生物这个大坑里面跳。记得本科入学的时候副系主任说：“二十一世纪是生物学的世纪。”然后他顿了1s，接着说：“我们都是被这句话骗进来的……”

全班黑线 (─.─|||

既然入坑了，就得努力挣扎。本文献给刚入生物科研坑的新生，老司机请忽略。

——进入正文——

PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前，PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟，包括聚合酶以及缓冲液的优化，使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样，分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说，整个PCR实验条件，基本可以模板化，而不需每做一个实验都从头开始摸条件。

然而PCR实验中，有一个环节是厂家无法帮我们优化的，那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为例，手把手教各位用最简单的方法，设计用于实时定量PCR研究基因表达水平的引物。在第二部分还会简单介绍，如何用相同的在线工具来评价引物。

（注：本文仅介绍的引物设计方法，仅适用于染料法qPCR之于基因表达定量研究，不涉及其他应用。像ORF克隆，没有特别的方法，就是老老实实在ORF一头一尾设计一对，用DNAStarlasergene等软件可以辅助设计，或者自己手动。而如果要做点突变、插入、删除，或者多片段组装，可以使用NEB相应的在线工具。）

第一部分：用PrimerBlast设计引物。

首先，上NCBI搜人EGFR基因。

往下拉，可以看到这个基因可能存在4种转录本。（NM开头的就是mRNA，其他暂时别管）

继续往下拉，找到各个转录本的具体信息，可以看到isoform a~d共4个转录本。

以isoform a为例，点击NM_005228.3那个超链接，进入下面这个页面。

点击右方的Pick Primers，进入引物设计的PrimerBlast页面。可以看到PCR Template那里已经帮你填好了。现在，其他地方暂时留空，把PCRproduct size的Max改成350。qPCR反应中，延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算，30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降，所以保守起见，将最大产物长度设为350bp甚至更低比较合适。太短也不行，否则跟引物二聚体分不开，所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合适的引物，那就把这个数字往上调，最好别超过500，要不然qPCR的反应条件就得改了（其实也就改延伸时间）。

接下来，Exon junction span选项改为Primermust span an exon-exon junction。这里的意思是，至少有一条引物跨过了外显子之间的连接处。这样就算有基因组DNA污染了cDNA，也不会被扩增出来，保证定量准确。当然如果有的基因硬是没有内含子，改了这个选项就会报错。

接下来的选项不用更改。Specificity check默认打钩，帮你跑引物特异性验证。Organism已经帮你自动填了人类（9606是Homo sapien的编号，你想研究其他物种，那就在一开始搜基因的时候搜对应的物种）。最后一行，如果你把钩打上的话，就会允许引物帮你扩增其他isoform（本例中就是isoform b~d）。当然，这不代表着会把所有isoform一起扩增，或者说强制一起扩增。如果需要这么做，我们需要返回前面更改一下设置。这一点第一部分的末尾注明。

点击Get Primers按钮，就会帮你设计引物了。由于是在线工具，请耐心等待几十秒。有时候人多，可能需要等几分钟。

很快我们就会看到这个页面，返回了10对引物。按照前面的默认条件，这些引物的退火温度都在60℃左右。

按照这个方法设计出来的引物，我做了那么多基因，成功率基本接近100%。这个在线工具的算法也在不断优化，按照近两三年的使用情况来看，没有遇到过失败的。（尤其是使用比较良心和稳定的试剂。在国内我是用天根，在美国是用原名biotool刚更名为bimake的试剂。好吧你说是软文我也懒得反驳，反正我就用这两家。这里也没有钦定的意思，我也用过Qiagen，Biorad和Thermo的，也能做得很好，但贵。）

那如果要同时扩增isoform a~d全部4个转录本，那怎么办呢？很简单，由于不同转录本之间同源性很强，基本上只有5’或者3’端有点差异，因此我们只需要指定引物落在所有转录本的共同区间就行了。

回到刚开始的页面，我们可以看到最短的是最下面的转录本。前面一共8个外显子（就是绿色的小竖线）是所有转录本都完全一致的。最后一个外显子从图上判断不清楚，但我们可以直接忽略。也就是说，我们只要让反向引物落在第8个外显子之前，就可以把所有4个转录本一起扩增出来了。

往下拉，这一例中我们可以随便点击任何一个转录本的NM那个超链接，比如还是isoforma，进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前，点击HighlightSequence Features。

然后你就会看到页面的底下变成了这个模样。我们把高亮的序列设置为exon，并高亮第8个外显子。目测一下，这个外显子一直到1252位碱基。记下这个数字。

回到上方，点击Pick Primers，并把反向引物的3’端边界设为1252。注意，不是5’端边界，否则就会强制反向引物一定要从1252之后开始。此例中，我们是要强制反(脱机使用打印机是什么意思：当电脑上显示出“脱机使用打印机”时，就表示电脑和打印机的连接已经断开，需要重新连接才能使用。)向引物不超过1252。其他的选项，按照本文前面讲述的方法进行调整。然后点击PickPrimers按钮。

此时傲娇的程序就会跳出来抗议说，你这样会P出其他的isoform。然而这就是我们要的结果。于是把所有的钩都选上。

点击Submit，再耐心等一会，就能得到能够扩增所有isoform的引物了。

神马？讲了那么多，还要是手把手式的，如果你还要问我怎么扩增其中一两个isoform而不是全部，那我劝你还是早点弃坑吧。[和善的眼神.jpg][微笑][再见]

顺便思考一下，如果isoform之间是5’端有差异，那到时候应该选择哪个转录本作为基准，参考哪个数字，改动哪个参数呢？我觉得，按照生物科研入坑者的平均智商都应该想得出来，这里就不解释了。

第二部分：用Primer Blast评价引物

有时候我们并不需要亲手设计引物，从文献或者数据库里面就可以找到。但在正式使用之前，我们可以利用Primer Blast来看看那些引物是否靠谱。

这里顺带介绍一下几个常用的引物数据库：

RTPrimerDB：RTPrimerDB: the real-time PCR primer and probe database

PrimerBank：PrimerBank

qPrimerDepot：https://primerdepot.nci.nih.gov/

具体如何使用就自己摸索了，都非常简单。

现在同样以人EGFR基因为例，我们从PrimerBank搜到一对引物。这时候，前面的方法还是一致的，但此时，把数据库的引物序列输入到Usemy own forward/reverse primer那里就可以了。PCR product size那里可以不用改，保持默认。但请更改下方的Exon junction span的设置为同前文所述一般。

此时拉到最下面，点击Get Primers，就会弹出结果页面。然而，针对这一对引物，我们却会发现如此结果，在Exon/Intron设置那里报错了。由于我们仅仅要求引物必须跨过外显子的连接处，这就代表，数据库的这一对引物并没有符合这一要求。

有时候我们会发现，程序认为引物可能存在非特异扩增。这时候先别慌。如红框所示，如果非特异的引物-模板结合，在引物的3’端末尾最后两个碱基，存在至少一个错配的时候，非特异PCR反应就几乎不可能进行。（Template的点代表完美互补配对，显示的字母为错配碱基）

我们甚至还能用Primer Blast来帮我们算一下，某一对引物到底能扩增出什么基因。具体怎么做，就自己研究了。（其实就是输入已知引物，Te

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